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本试剂盒可从多种样品中高效提取出总RNA。使用柱式方法可轻易从动物或人类细胞和组织中提取出总RNA。

生物样品首先在变性胍盐缓冲液(Buffer RLT)中被裂解和匀浆，这种缓冲液可立即将DNases、RNases和蛋白酶失活，确保了提取RNA的完整性。匀浆液中的RNA被选择性吸附到SD-10 Spin Column，所有蛋白以及其他成分在离心过程中被除去。残留的污染物和盐离子在洗涤过程中被有效去除。提取的RNA在RNase-free水中被洗脱出来，OD260/OD280比值通常为1.9-2.1（在10mM Tris-Cl，pH7.5中检测），非常适用于Northern blotting，RT-PCR，定量PCR，Poly (A) RNA筛选和阵列分析等大多数下游应用。

• 快速。使用快速的柱式提取方式，整个过程不超过20minutes。
  
• RNA质量高。提取的RNA OD260/OD280比值为1.9～2.0。
  
• 适用范围广。适用于从多种样品比如细菌、真菌、动物和一些植物中提取总RNA。

• 第一次使用前，向DW solution和RPE solution中加入指定量的乙醇，配制成工作液。
  

  	50次	100次	250次
  DW Solution	36mL	72mL	180mL
  乙醇(96～100%)	4mL	8mL	20mL
  DW最终体积	40mL	80mL	200mL

  
  

  	50次	100次	250次
  RPE Solution	12mL	24mL	60mL
  乙醇(96～100%)	48mL	96mL	240mL
  RPE最终体积	60mL	120mL	300mL

  
  
• 低温时Buffer RLT和DW Solution (concentrate)可能会出现盐沉淀。将溶液加热至56℃可溶解沉淀，溶液降至室温后再使用。
  
• 操作RNA相关实验时要十分小心。从RNA样品的准备到后续的纯化和分析均应保持在RNase-free的环境中。使用RNase- free离心管、枪头、凝胶。始终佩戴手套。

• 离心速度至少达到12000×g的小型离心机
  
• RNase-Free的移液枪和枪头以及漩涡振荡器
  
• RNase-Free离心管(1.5mL或2mL)
  
• 乙醇(96～100%)
  
• RNase-Free水
  
• 溶菌酶溶液：
  
  • 革兰氏阴性菌：用RNase-free水配制成400μg/mL溶菌酶溶液
    
  • 革兰氏阳性菌：用RNase-free水配制成3mg/mL溶菌酶溶液

• 样品准备
  
  • 粘附细胞：除去培养基，将0.3mL Buffer RLT加入到大概4cm2的细胞中，轻轻吹打混匀。
    
  • 悬浮细胞：离心收集细胞，弃上清，将0.3mL Buffer RLT加入到1×10⁶个细胞中，轻轻吹打混匀。
    注：成纤维细胞或癌细胞数量不要超过1×10⁶个。
    
  • 动物组织：
    
    • 将组织剪成小块，用液氮研磨成粉末，10～20mg组织中加入0.3mL Buffer RLT。
      注：
      ① 对于含细胞数量较多的组织，比如脾，使用量不要超过10mg。
      ② 加入Buffer RLT前不要让组织样品解冻。
      
    • 充分漩涡混匀，室温孵育5min。
      注：孵育后，溶解产物可能会变得粘稠，但不应该是凝胶状。如果出现凝胶状，剧烈振荡混匀。
      
    • 加入0.59mL RNase-free水和10μL proteinase K。充分混匀，55℃孵育10min。
      
    • 12000×g，4℃离心3min。将上清转移到一个新的RNase-free 1.5mL离心管中。
  • 植物组织：
    
    • 将组织剪成小块，用液氮研磨成粉末，加入0.3mL Buffer RLT到25mg植物组织中。漩涡充分混匀，室温孵育5min。
      注：加入Buffer RLT前不要让植物样品解冻。
      
    • 12000×g，4℃离心3min。将上清转移到一个新的RNase-free 1.5mL离心管中。
  • 革兰氏阴性细菌：
    
    • 取1mL对数期（大概2×10⁹个细菌）的细菌到离心管中，10000×g离心30s，弃上清。
      
    • 加入100μL溶菌酶溶液(用RNase-free水配制成400μg/mL溶菌酶溶液，本试剂盒未提供)充分悬浮菌体，37℃孵育5min。
      
    • 加入0.3mL Buffer RLT，漩涡充分混匀，室温静置5min。
  • 革兰氏阳性菌：
    
    • 取1mL对数期（大概2×10⁹个细菌）的细菌到离心管中，10000×g离心30s，弃上清。
      
    • 加入100μL溶菌酶溶液(用RNase-free水配制成3mg/mL溶菌酶溶液，本试剂盒未提供)充分悬浮菌体，37℃孵育5min。
      
    • 加入0.3mL Buffer RLT，漩涡充分混匀，室温静置5min。
• 加入1/2体积乙醇，将离心管颠倒混匀。
  
• 将SD-10 Spin Column放入2mL收集中。将步骤2中的混合液加入到吸附柱，室温12000×g离心2min，倒掉收集管中的液体。
  注：如果样品体积超过0.7mL，在同一吸附柱中分次离心。确保离心后吸附膜上无液体残留。
  
• 将SD-10 Spin Column放回收集管中，加入0.35mL DW Solution，室温12000×g离心1min，倒掉收集管中的液体。
  注：
  ① 检查DW Solution是否已加入乙醇。
  ② 如果使用的是RNase-Free DNA清除试剂盒，完成步骤4后开始使用RNase-Free DNA清除试剂盒(货号：GS2266)。
  
• 加入0.5mL RPE Solution到吸附柱中，室温12000×g离心1min，倒掉收集管中的液体。
  注：检查RPE Solution是否已加入乙醇。
  
• 重复步骤5一次。
  
• 吸附柱在室温12000×g离心2min。将吸附柱开盖，室温静置2min，直到乙醇完全挥发。
  注：
  ① 这一步骤对去除残留的乙醇非常重要。
  ② 残留的乙醇可能会干扰后续反应。
  
• 将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μL RNase-free水，室温静置2min。
  
• 室温12000×g离心1min。
  注：
  ① 离心管中的溶液为RNA样品，可直接用于后续分子生物学实验或保存于-70℃。
  ② 对于DNA含量特别高的组织(比如胸腺)，可尝试使用RNase-Free DNA清除试剂盒(货号：GS2266)，以去除基因组DNA。